Western blotting

Immunoblotting är överföring av proteiner till ett membran och efterföljande detektion med användning av antikroppar. För det kända uttryckta proteinet kan motsvarande antikropp användas som den primära antikroppen för detektion. Uttrycksprodukten av den nya genen kan detekteras av fusionsdelen av antikroppen, och har fördelarna med stor analytisk kapacitet, hög känslighet, stark specificitet etc. En av de mest använda metoderna för expression och distribution, såsom kvalitativ och kvantitativ detektion av vävnadsantigener, massbestämning av polypeptidmolekyler, och detektion av antikroppar eller antigener mot virus. Grundläggande information Specialistklassificering: klassificering av tillväxt och utveckling: biokemisk undersökning Tillämpligt kön: om män och kvinnor tillämpar fasta: inte fasta Tips: Följ läkarens instruktioner. Normalt värde Ingen speciell färgreaktion. Klinisk betydelse Onormala resultat: Det finns en speciell färgreaktion, som bevisar att ett visst protein finns. Behöver kontrollera publiken: kolla efter ett visst protein. försiktighetsåtgärder Tabu vid kontroll: Inget. Tabu vid kontroll: 1. Utspädning, verkningstid och temperatur för den primära antikroppen och den sekundära antikroppen bestäms genom för-experiment för att bestämma de optimala förhållandena för olika proteiner. 2. Färgutvecklingslösningen måste konfigureras och användas nyligen och slutligen läggs H2O2 till. 3, DAB har potential för cancerframkallande egenskaper, var försiktig vid hantering. Inspektionsprocess (A) proteinprov erhållet: efter bakteriell induktion av expression kan cellerna direkt lyseras med elektroforesbelastningsbuffert, eukaryota celler plus homogeniseringsbuffert, mekanisk eller ultraljudshastighetstemperatur homogenat 0,5-1min. Den centrifugerades sedan vid 13 000 g under 15 minuter vid 4 ° C. Ta supernatanten som ett prov. (2) Elektrofores: En elektroforesgel bereddes och utsattes för SDS-PAGE. (3) Överföring: (halvtorr överföring) 1. När elektroforesen är klar klipps remsan till lämplig storlek och jämviktas med membranbufferten, 5 min × 3 gånger. 2. Membranbehandling: Filterpapper och NC-membran av samma storlek som remsan förskärdes och nedsänktes i överföringsbufferten i 10 minuter. 3. Överföringsfilm: Filmöverföringsanordningen placeras i ordning från botten till topp enligt ordningen för anodkolplatta, 24 lager filterpapper, NC-film, gel, 24 lager filterpapper och katodkolplatta. Filterpapper, gel och NC-film är exakt i linje. Bubblorna avlägsnades i ett steg och en vikt av 500 g applicerades därpå för att torka överskottsvätskan på kolplattan. Slå på strömmen, konstant ström 1mA / cm2, överför 1,5 tim. Efter överföringen avlägsnas kraften och membranet tas ut, och remsan som ska testas skärs för immunblotting. Proteinstandardremsorna färgades, placerades i membranfärgningslösningen under 50 s och avfärgades sedan i 50% metanol flera gånger till en klar bakgrund, tvättades sedan med dubbelt destillerat vatten, lufttorkades i två lager filterpapper och lämnades att färga Resultaten jämförs. (4) Immunsvar: 1. Tvätta membranet med 0,01 M PBS i 5 minuter x 3 gånger. 2. Tillsätt beläggningslösningen och skaka försiktigt vid rumstemperatur i 2 timmar. 3. Kasta lösningen och tvätta membranet med 0,01 M PBS i 5 minuter × 3 gånger. 4. Tillsätt primär antikropp (utspädd med 0,01 M PBS i ett lämpligt utspädningsförhållande, vätskan måste täcka hela membranet) och låt stå vid 4 ° C i mer än 12 timmar. I den negativa kontrollen ersattes den primära antikroppen med 1% BSA, och de återstående stegen var desamma som i experimentgruppen. 5. Kassera den primära antikroppen och 1% BSA och tvätta membranet med 0,01 M PBS, 5 min × 4 gånger. 6. Tillsätt pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundär antikropp (utspädd med 0,01 M PBS vid lämpligt utspädningsförhållande) och skaka försiktigt i 2 timmar vid rumstemperatur. 7. Kassera den sekundära antikroppen och tvätta membranet med 0,01 M PBS under 5 minuter × 4 gånger. 8. Tillsätt färglösningen, undvik ljuset och utveckla färg tills bandet visas. Lägg i det dubbla destillerade vattnet för att stoppa reaktionen. Inte lämplig för publiken Inte lämplig för publiken: nej. Biverkningar och risker Inga relaterade komplikationer eller faror.

Materialet på denna webbplats är avsett att vara allmänt informativt bruk och är inte avsett att utgöra medicinsk rådgivning, sannolik diagnos eller rekommenderade behandlingar.