Análise de DNA por citometria de fluxo

A análise de DNA por citometria de fluxo é um método de exame que pode estudar células em interfase e não é afetado pelo estado de proliferação celular, sendo importante para a detecção de células malignas no derrame pleural. Intervalo de detecção de citometria de fluxo: 1. A citometria de fluxo pode detectar a estrutura celular, incluindo tamanho da célula, tamanho da célula, área de superfície celular, razão nucleoplásmica, conteúdo de DNA e ciclo celular, conteúdo de RNA, teor de proteína. 2. A citometria de fluxo pode detectar funções celulares, incluindo antígenos específicos da superfície celular / citoplasmáticos / nucleares, atividades celulares, citocinas intracelulares, atividades enzimáticas, sítios de ligação a hormônios e receptores celulares. Informação básica Classificação especializada: classificação do exame cardiovascular: exame de sangue Sexo aplicável: se homens e mulheres aplicam jejum: não jejuar Dicas: Mantenha uma mentalidade normal. Valor normal O corpo está em equilíbrio dinâmico sem doença. Significado clínico Aplicação clínica da citometria de fluxo: 1. Aplicao de citometria de fluxo em oncologia A citometria de fluxo pode detectar o ciclo de proliferao de culas tumorais, detectar marcadores de superfie de culas tumorais, produtos de express oncogicos, realizar anise de resistcia a mtiplos fmacos e detectar apoptose; 2. Aplicação de citometria de fluxo em hematologia para detectar células de leucemia e linfoma, plaquetas ativadas, contagem de células-tronco hematopoiéticas (CD34 +), imunofenotipagem de leucemias e linfomas, contagem de reticulócitos, correspondência cruzada de transplante de células e Monitoramento do estado imunológico; 3. A citometria de fluxo em imunologia pode ser usada para análise de linfócitos e seus subgrupos, imunofenotipagem de linfócitos, detecção de citocinas. Resultados anormais Foram encontrados dados da análise por citometria de fluxo de 71 casos de derrame pleural, os resultados mostraram que a sensibilidade do derrame pleural maligno foi de 52% e a especificidade foi de 100%. Se usado em conjunto com testes de rotina, a sensibilidade do diagnóstico pode ser tão alta quanto 94%. A anise de ADN de culas de efus pleural cancerosas mostrou um aumento na proporo de culas aneuploides e fase S, fase G2 / M. As pessoas que precisam ser examinadas são suspeitas de ter derrame pleural e outras doenças relacionadas. Precauções A citometria de fluxo não é um instrumento totalmente automatizado, os resultados experimentais precisos requerem técnicas manuais precisas, portanto, a preparação da amostra requer especificação e o próprio instrumento requer controle de qualidade. (1) Fatores de influência e controle de qualidade da detecção imunológica por citometria de fluxo A citometria de fluxo tem uma ampla gama de aplicações em imunologia.A preparação de amostras de coloração de imunofluorescência é muito importante, muitas vezes devido à ocorrência de interferência de fluorescência não específica antropogênica (especialmente na coloração de imunofluorescência indireta) ou baixa concentração de células durante a preparação da amostra. Resultados do teste. As soluções para esses fatores de influência são as seguintes: (1) Certifique-se de que a concentração da amostra antes da máquina ser detectada é de 1x106 células / ml, e a concentração da célula é muito baixa, o que afeta diretamente o resultado da detecção. (2) O uso de agentes bloqueadores de proteínas para bloquear sítios de ligação não específicos é especialmente necessário para a marcação por imunofluorescência indireta. Agentes bloqueadores de proteínas comumente usados ​​são 0,5% de albumina de soro bovino e 1% de soro bovino fetal. (3) O anticorpo fluorescente é lavado completamente após a coloração, atenção à velocidade de mistura e centrifugação e reduz as células sobrepostas e os resíduos celulares. (4) Uma amostra de controlo foi estabelecida utilizando um controlo de fundo de controlo não relacionado e anticorpos fluorescentes que correspondiam à mesma fonte de anticorpo. (5) Ao julgar o resultado, deve-se prestar atenção à subtração da fluorescência de fundo, a fim de tornar a análise quantitativa da imunofluorescência mais precisa, o programa de computador é utilizado para subtrair o pico da curva do grupo controle do pico da curva pelo método da curva de ajuste. Resultados quantitativos de imunofluorescência mais precisos podem ser obtidos. (6) Preste atenção para evitar a luz após o tingimento para garantir a estabilidade da imunofluorescência celular. (2) Ainda não há um padrão uniforme para o controle de qualidade da análise de ploidia de DNA.Os resultados experimentais relatados em várias literaturas são bastante diferentes.Em outubro de 1993, a American Cancer Research Organization desenvolveu um padrão unificado para a determinação de DNA de FCM, que combinamos de acordo com esses padrões. Experientes experientes vêm praticando há muitos anos para explicar o controle de qualidade e as precauções da tecnologia de análise de DNA da FCM. (1) Quando espécimes frescos para ressecção cirúrgica ou agulhas de biópsia são tomadas, o tecido necrótico hemorrágico deve ser evitado. (2) Os espécimes devem ser fixados ou criopreservados no tempo após a coleta para evitar autólise e degradação do DNA, resultando em erros nos resultados do teste. (3) O fixador deve adotar uma concentração que seja altamente penetrante para as células do tecido, e 70% do etanol é melhor. (4) Durante a preparação da suspensão de célula única, tenha o cuidado de separar os componentes das células a serem testadas, reduzir a interferência de outros componentes e ter cuidado para não danificar as células. (5) A recolha de amostras celulares deve assegurar uma concentração celular suficiente, isto é, 1 × 10 6 células / ml, impurezas, detritos, aglomerados e células sobrepostas deve ser <2%, e pelo menos 20% das amostras de aneuploides de ADN de células tumorais devem ser analisadas. Células tumorais estão presentes. (6) Ao preparar a célula única de tecido embebido em parafina, deve-se prestar atenção à seleção do tecido sem autólise e necrose.Para a amostra de tecido do tumor, a área contendo as células tumorais é selecionada, a espessura da folha de tecido de parafina deve ser adequada, de preferência 40 a 50 μm. Fatias excessivamente finas ou muito espessas afetarão os resultados do teste, completamente desparafinadas para evitar que a parafina residual afete a atividade digestiva da enzima Verifique se o desparafinamento está completo, descartando o xileno e adicionando 100% de etanol. Flutuante, indicando que a cera foi removida, a hidratação é suficiente para restaurar o tecido a um estado semelhante ao tecido fresco, preste atenção ao tempo de digestão e à atividade das enzimas digestivas. 0,5% de pepsina foi usada rotineiramente, pH 1,5. (3) Aspectos operacionais (1) O citômetro de fluxo está em um estado ideal durante todo o processo de trabalho, o que pode garantir a precisão e exatidão da detecção quantitativa. Usando a amostra padrão para ajustar o coeficiente de variação do instrumento para a faixa mínima, a resolução está no melhor estado, para evitar erros de detecção causados ​​por mudanças nas condições do instrumento durante o processo de medição. (2) O índice importante para avaliar a precisão do instrumento é o coeficiente de variação (CV) do instrumento Para a amostra de calibração, quanto menor o valor de CV, menor o valor de CV, indicando que a precisão da calibração do instrumento é maior. As amostras de calibração incluem amostras não biológicas (microesferas fluorescentes) e amostras de células biológicas (linfócitos humanos, glóbulos vermelhos de galinha, etc.). Actualmente, as microesferas não bioluminescentes têm reagentes comerciais e o CV é geralmente <2% a 3%. (4) Análise de dados (1) Quando existem demasiados detritos ou aglomerados na amostra, o número de células medido é inferior a 20% e a linha de base do histograma deve ser abandonada. (2) Ao realizar a análise do ciclo celular, o número de células da amostra deve ser 10.000, excluindo detritos, impurezas e aglomerados Quando o número de células aneuplóides é menor que 10% do número total de células, é necessário combinar outros indicadores diagnósticos. Em conclusão, pelo menos células aneuplóides representam mais de 20% do número total de células, e a presença de aneuploides pode ser determinada. (3) Na análise de DNA, a análise foi abandonada quando o valor de CV do grupo de células diplóides normais era> 8%, mas o valor de CV das células de tumor era> 8%, o que estava relacionado à heterogeneidade das células tumorais. Além disso, na análise de ploidia de DNA, 10% dos indivíduos no tecido homólogo se deslocarão. (4) Controle de qualidade dos padrões de ploidia de DNA, usando o mesmo tecido normal homólogo individual, o mesmo método de fixação, o mesmo método de processamento da amostra, o mesmo método de coloração, coloração simultânea, as mesmas condições de detecção do instrumento, tecido diploide normal Padrão interno. Processo de inspeção Anise de citometria de fluxo: as culas no fluido pleural foram coradas directamente com corantes fluorescentes (tal como iodeto de propio), e o conteo em ADN, a distribuio do ciclo celular e a ploidia do ADN das culas do luido pleural foram analisadas por citometria de fluxo. Preparação de amostras para testes de rotina por citometria de fluxo: (1) rotulagem de imunofluorescência direta Tome uma certa quantidade de células (cerca de 1X106 células / ml), adicione diretamente o anticorpo conjugado com fluoresceína para a reação de imunomarcação (como coloração dupla ou multi-marcada, adicione vários anticorpos marcados com diferentes fluoresceína ao mesmo tempo), incube Após 20 a 60 minutos, lavar com PBS (pH 7,2 a 7,4) por 1 ou 2 vezes, ressuspender em tampão e testar na máquina. O método tem as vantagens de operação simples, resultado preciso e fácil análise, e é adequado para a determinação simultânea de múltiplos parâmetros do mesmo grupo de células. Embora o custo do reagente de anticorpo marcado diretamente seja alto, ele reduz a interferência de forte fluorescência não específica no método de marcação indireta e, portanto, é mais adequado para a detecção de amostras clínicas. (dois) rotulagem de imunofluorescência indireta Tome uma certa quantidade de suspensão celular (cerca de 1X106 células / ml), primeiro adicione um primeiro anticorpo específico, lave o anticorpo não ligado após a reação estar completa, e então adicione um anticorpo secundário marcado fluorescentemente para formar um complexo antígeno-anticorpo-anticorpo. O FCM detecta a fluorescência emitida pela fluoresceína marcada depois de excitada. O método é de baixo custo e o anticorpo secundário é amplamente utilizado e é usado principalmente para a detecção de amostras científicas. No entanto, uma vez que o anticorpo secundário é geralmente um anticorpo policlonal, a especificidade é fraca e o fundo fluorescente não específico é forte, o que afeta facilmente os resultados experimentais. Portanto, um controle negativo ou positivo deve ser adicionado à preparação da amostra. Além disso, devido ao grande número de etapas no método de rotulagem padrão, a perda de células é aumentada e não é adequado para medir espécimes com um pequeno número de células. Não é adequado para a multidão Não

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