ウェスタンブロッティング

イムノブロッティングとは、タンパク質を膜に転写し、その後抗体を使用して検出することです。 既知の発現タンパク質の場合、対応する抗体を検出の一次抗体として使用できます。新しい遺伝子の発現産物は、抗体の融合部分によって検出でき、大きな分析能力、高感度、強い特異性などの利点があります。組織抗原の定性的および定量的検出、ポリペプチド分子の質量測定、ウイルスの抗体または抗原の検出など、最も一般的に使用される発現および分布の方法の1つ。 基本情報 専門家分類：成長および発達チェック分類：生化学検査 該当する性別：男性と女性が断食を適用するかどうか：断食をしない ヒント：医師の指示に従ってください。 正常値 特別な色反応はありません。 臨床的意義 異常な結果：特定のタンパク質が存在することを証明する特別な色反応があります。 群衆を確認する必要があります：特定のタンパク質を確認してください。 注意事項 チェック時のタブー：なし。 チェック時のタブー： 1.一次抗体と二次抗体の希釈、作用時間、温度は、さまざまなタンパク質に最適な条件を決定するための事前実験によって決定されます。 2.発色現像液を新たに構成して使用する必要があり、最後にH2O2が追加されます。 3、DABには発がん性の可能性があるため、取り扱いには注意してください。 検査プロセス （A）得られたタンパク質サンプル：細菌による発現の誘導後、電気泳動ローディングバッファー、真核細胞とホモジナイゼーションバッファー、機械的または超音波室温ホモジネート0.5-1分で細胞を直接溶解できます。 次に、4℃で15分間13,000gで遠心分離しました。 サンプルとして上清を取ります。 （2）電気泳動：電気泳動ゲルを調製し、SDS-PAGEにかけた。 （3）転送：（セミドライ転送） 1.電気泳動が終了したら、ストリップを適切なサイズに切断し、膜バッファーで5分×3回平衡化します。 2.膜処理：ストリップと同じサイズの濾紙とNC膜を事前に切断し、転写バッファーに10分間浸漬しました。 3.転写フィルム：フィルム転写装置は、アノードカーボンプレート、24層のろ紙、NCフィルム、ゲル、24層のろ紙およびカソードカーボンプレートの順序に従って下から上に順番に配置されます。気泡は一段階で除去され、５００ｇの重量がそれに加えられ、カーボンプレート上の過剰な液体を乾燥させた。 電源を入れ、定電流1mA / cm2、1.5時間を転送します。 転写が完了したら、電源を切り、膜を取り出し、試験するストリップをイムノブロッティング用に切断します。 タンパク質標準ストリップを染色し、膜染色溶液に50秒間入れ、50％メタノールで数回脱色して透明な背景にし、再蒸留水で洗浄し、2層のろ紙で風乾し、放置して着色しました結果が比較されます。 （4）免疫反応： 1. 0.01 M PBSで5分間x 3回膜を洗浄します。 2.コーティング溶液を加え、室温で2時間穏やかに振とうします。 3.溶液を捨て、膜を0.01 M PBSで5分×3回洗浄します。 4.一次抗体（適切な希釈率で0.01 M PBSで希釈、液体は膜全体を覆う必要がある）を追加し、4°Cで12時間以上放置します。 ネガティブコントロールでは、一次抗体が1％BSAに置き換えられ、残りのステップは実験グループと同じでした。 5.一次抗体と1％BSAを廃棄し、膜を0.01 M PBSで5分×4回洗浄します。 6.西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（適切な希釈率で0.01 M PBSで希釈）を加え、室温で2時間穏やかに振とうします。 7.二次抗体を捨て、メンブレンを0.01 M PBSで5分×4回洗浄します。 8.着色溶液を加え、光を避け、バンドが現れるまで発色し、再蒸留水を入れて反応を停止します。 群衆に適していない 群衆に適していない：いいえ。 副作用とリスク 関連する合併症や危険はありません。

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