Detección inmunológica de Helicobacter pylori

Las pruebas inmunológicas de Helicobacter pylori detectan la infección por H. pylori midiendo los anticuerpos contra el Helicobacter pylori en suero, incluidos los ensayos de hemaglutinación pasiva, las técnicas de inmunotransferencia y los ensayos de inmunosorción enzimática (ELISA). El paciente tomó el líquido cefalorraquídeo y diluyó el antígeno con la placa de hemaglutinación tipo V de 96 pocillos para diluir el antígeno JE, de modo que cada pocillo contenía 25 μl, y el suero a analizar se diluyó 1:10 con cada dilución. Agregue 25 ul, agregue anticuerpo monoclonal cerebral liofilizado japonés para sensibilizar los glóbulos rojos de oveja 25 ul, y observe los resultados después de permanecer a 37 ° C durante varias horas. Información básica Clasificación de especialistas: clasificación de exámenes de crecimiento y desarrollo: examen de sangre Género aplicable: si los hombres y las mujeres aplican el ayuno: ayuno Consejos: Mantenga el estómago vacío del examen. Valor normal El resultado fue negativo. Importancia clínica Resultados anormales: 1. El título de aglutinación en suero de la prueba es 4 veces o más de 4 veces mayor que el control de antígeno. El título de antígeno sérico durante el período de recuperación fue 4 o más veces mayor que la fase aguda y fue positivo. 2. Hay una reacción especial de color, que prueba que existe cierta proteína. 3. La proporción del suero a analizar con respecto al suero negativo conocido (P / N) ≥ 2.1, y el valor de OD del suero a analizar es ≥ 0.4, luego se considera positivo. Necesito revisar la multitud: pacientes con úlcera péptica. Precauciones Contraindicaciones antes de la inspección: preste atención a la protección del cerebro; prepare varios líquidos de embalaje y configure la concentración. Tabú al verificar: 1. El paciente toma el líquido cefalorraquídeo para sentarse, para no lastimar la cabeza. 2. Anticuerpos monoclonales utilizados para sensibilizar los glóbulos rojos de las ovejas para liofilizarlos antes de su uso. 3. La dilución, la duración de la acción y la temperatura de los anticuerpos primarios y secundarios se deben experimentar previamente para determinar las condiciones óptimas para las diferentes proteínas. 4. La solución de revelado de color debe estar recién configurada y finalmente agregada a H2O2. 5. DAB tiene el potencial de causar cáncer, así que tenga cuidado al manipularlo. 6. Controlar estrictamente los factores que afectan la eficiencia del etiquetado, como la temperatura, el tiempo, el pH, la cantidad de enzimas y anticuerpos. 7. Al instalar la columna, haga que la columna sea uniforme, la superficie del cilindro es plana y no hay burbujas ni grietas. Proceso de inspección Primero, la coagulación pasiva de la sangre. El paciente tomó el líquido cefalorraquídeo y diluyó el antígeno con la placa de hemaglutinación tipo V de 96 pocillos para diluir el antígeno JE, de modo que cada pocillo contenía 25 μl, y el suero a analizar se diluyó 1:10 con cada dilución. Agregue 25 μl y agregue 25 μl de glóbulos rojos de oveja sensibilizados con anticuerpo monoclonal cerebral japonés liofilizado, y observe los resultados después de permanecer a 37 ° C durante varias horas. En segundo lugar, la tecnología de inmunotransferencia (A) muestra de proteína obtenida: después de la inducción bacteriana de la expresión, las células se pueden lisar directamente mediante tampón de carga de electroforesis, células eucariotas más tampón de homogeneización, homogeneizado mecánico o ultrasónico a temperatura ambiente 0.5-1min. Luego se centrifugó a 13,000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Tome el sobrenadante como muestra. (2) Electroforesis: se preparó un gel de electroforesis y se sometió a SDS-PAGE. (3) Transferencia: (transferencia semiseca) 1. Una vez finalizada la electroforesis, corte la tira al tamaño apropiado y equilibre con el tampón de membrana, 5 min × 3 veces. 2. Tratamiento de membrana: el papel de filtro y la membrana NC del mismo tamaño que la tira se cortaron previamente y se sumergieron en el tampón de transferencia durante 10 minutos. 3. Película de transferencia: el dispositivo de transferencia de película se coloca en orden de abajo hacia arriba de acuerdo con el orden de la placa de carbono del ánodo, 24 capas de papel de filtro, película de NC, gel, 24 capas de papel de filtro y placa de carbono de cátodo. El papel de filtro, el gel y la película de NC están alineados con precisión. Las burbujas se eliminaron en una etapa, y se aplicó un peso de 500 g a la misma para secar el exceso de líquido en la placa de carbón. Encienda la energía, corriente constante 1mA / cm2, transfiera 1.5hr. Después de que se completa la transferencia, se quita la energía y se saca la membrana, y la tira a analizar se corta para inmunotransferencia. Las tiras estándar de proteína se tiñeron, se colocaron en la solución de tinción de membrana durante 50 segundos y luego se decoloraron en metanol al 50% varias veces hasta un fondo claro, luego se lavaron con agua doblemente destilada, se secaron al aire en dos capas de papel de filtro y se dejaron a color. Los resultados son comparados. (4) Respuesta inmune: 1. Lave la membrana con PBS 0.01 M durante 5 min x 3 veces. 2. Agregue la solución de recubrimiento y agite suavemente a temperatura ambiente durante 2 horas. 3. Deseche la solución y lave la membrana con PBS 0.01 M durante 5 min × 3 veces. 4. Agregue el anticuerpo primario (diluido con PBS 0.01 M en una proporción de dilución adecuada, el líquido debe cubrir toda la membrana) y déjelo a 4 ° C durante más de 12 h. En el control negativo, el anticuerpo primario se reemplazó con 1% de BSA, y los pasos restantes fueron los mismos que en el grupo experimental. 5. Deseche el anticuerpo primario y el 1% de BSA, y lave la membrana con PBS 0.01 M, 5 min × 4 veces. 6. Agregue el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (diluido con PBS 0.01 M en la proporción de dilución apropiada) y agite suavemente durante 2 horas a temperatura ambiente. 7. Deseche el anticuerpo secundario y lave la membrana con PBS 0.01 M durante 5 min × 4 veces. 8. Agregue la solución colorante, evite la luz y desarrolle el color hasta que aparezca la banda. Coloque el agua doblemente destilada para detener la reacción. Tercero, la determinación de adsorción combinada de enzimas Los métodos ELISA de uso común incluyen un método sandwich de doble anticuerpo y un método indirecto, el primero para detectar antígenos macromoleculares y el segundo para medir anticuerpos específicos. ELISA indirecto Este método se usa principalmente para detectar anticuerpos. El procedimiento para ELISA indirecto es el siguiente. (1) Materiales 1 líquido de recubrimiento, líquido de lavado, líquido de conservación de calor, líquido de sustrato y líquido de parada; Antígeno recubierto con 2DVH, anti-anticuerpo marcado con enzima, suero de referencia DVH negativo y positivo; 3 Detector ELISA, muestra, microplaca de poliestireno. (2) Pasos del método 1 recubrimiento de antígeno más → 4 ° C durante la noche, lavar tres veces, secar; 2 más suero a analizar → 37 ° C durante 2 horas, lavar tres veces, secar; Anticuerpo marcado con 3 enzimas más → 37 ° C durante 2 horas, lavado tres veces, secar; 4 agregue la solución de sustrato → 37 ° C durante 30 minutos, agregue la solución de parada; 5 El valor de OD se midió mediante un detector ELISA y se calculó la relación P / N. 2. ELISA sandwich de doble anticuerpo Este método se utiliza principalmente para detectar antígenos macromoleculares. 1 recubrimiento de anticuerpo más → 4 ° C durante la noche, lavado tres veces, secar; 2 más el antígeno a analizar → 37 ° C durante 30 minutos, lavar tres veces, secar; Anticuerpo marcado con 3 enzimas más → 37 ° C durante 30 minutos, lavado tres veces, secar; 4 agregue la solución de sustrato → 37 ° C durante 15 minutos, agregue la solución de parada; 5 El valor de OD se midió mediante un probador de ELISA. No apto para la multitud. No es adecuado para controlar a la multitud: ninguno. Reacciones adversas y riesgos No hay complicaciones o riesgos relacionados.

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